Aplicação de bioensaios em Produtos Naturais

A forma de investigação e pesquisa de novos compostos biologicamente ativos alterou significativamente nas últimas décadas em função dos avanços tecnológicos. Neste contexto, a avaliação biológica dinamizou significativamente a área de produtos naturais. O aumento do número de testes com receptores, enzimas e entendimento de mecanismos que envolvem as mais diversas patologias, propiciaram o desenvolvimento de bioensaios eficazes e de rápida execução. A modernização dos ensaios permitiu a utilização de enzimas, receptores, DNA, entre outros alvos, para avaliação de grandes quantidades de amostras em curtos intervalos de tempo.

Os bioensaios podem ser utilizados para monitorar atividades biológicas provenientes de produtos naturais de origem vegetal ou animal ou mesmo de produtos de síntese orgânica.

No caso dos produtos naturais observa-se que os vegetais são responsáveis por uma produção de uma variedade de substâncias, dentre as quais uma ou algumas são responsáveis pela atividade biológica. Então se faz necessário dispor de testes eficazes e de rápida execução como os bioensaios para localizar a atividade, seja no extrato da planta ou em uma de suas numerosas frações obtidas nas diferentes etapas de separação e purificação.

Dentre os bioensaios mais utilizados em estudos de biomonitoramento,  utiliza-se de ensaios simples como o teste de toxicidade frente a Artemia salina, testes para detectar atividade antioxidante, teste de inibição da enzima acetilcolinesterase, testes antimicrobianos, teste alelopático, entre outros.

O teste de toxicidade frente a Artemia salina surgiu como um substituto, mais barato e simples, para os ensaios citotóxicos com células1. Este teste detecta também um amplo espectro de atividades biológicas, pois parte-se do principio que extratos ou substâncias que são tóxicos a pequenos organismos como A. salina, podem ser potencialmente ativos. Para o teste de toxicidade frente a Artemia salina as amostras são diluídas em diferentes concentrações (100 – 1000 ug.mL^-1) e colocadas na presença das larvas deste microcrustáceo. A mortalidade das mesmas é observada após 24 horas de exposição.  As análises são feitas em triplicata e o resultado é expresso, como a dose necessária para matar 50% das larvas DL₅₀, obtido através do gráfico da % de animais sobreviventes em função do logarítmo da dose testada, com um intervalo de confiança de 95% ¹.

A atividade antioxidante utilizando o cromóforo radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) é um exemplo de um teste antioxidante e detecta substâncias com capacidade de reagir com radicais livres, que são espécies responsáveis por um grande número de doenças como câncer, doenças do coração, inflamações, assim como pelo processo de envelhecimento2. O teste do DPPH é baseado na capacidade do radical livre estável, 1,1-difenil-2-picrilidrazil, reagir com compostos doadores de H⁺, o que pode interromper as reações oxidativas em cadeia. O DPPH pode reagir com compostos fenólicos, bem como com ácidos aromáticos contendo apenas um grupamento, mas não reage com flavonóides³. Outros métodos como aqueles baseados na redução do Fe⁺³, que determinam o poder redutor frequentemente são utilizados para avaliação da atividade antioxidante. Tais métodos avaliam a capacidade de compostos fenólicos reduzirem o Fe⁺³, com conseqüente formação de um complexo colorido com Fe^{+2 4}.

Outros testes podem ser usados para avaliar atividade antioxidante em extratos e frações vegetais como a determinação do conteúdo de flavonóides e determinação do da atividade antioxidante total usando o ion molibddato.

Algumas pesquisas apontam fármacos provenientes de produtos naturais como sendo possíveis inibidores da acetilcolinesterase e eficazes no tratamento do mal de Alzheimer, como a galantamina, um alcalóide isolado de plantas da família Amarilidaceae (Galanthus woronowi). Este alcaloide é um inibidor competitivo da acetilcolinesterase, possui longa atuação e é bastante seletiva. Foi recentemente aprovada pelo FDA para tratamento de pacientes com Alzheimer ⁵.O ensaio para a detecção de compostos que inibam a atividade da enzima acetilcolinesterase se fundamente na medida da produção de tiocolina, quando o substrato acetiltiocolina é hidrolisado pela enzma acetilcolinesterase (AChE). Esta reação é acompanhada pelo aparecimento de uma coloração amarela medida a 405 nm  devido anion 5-tio-2-nitrobenzoato obtido da reação do reagente de Elman (ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico) com a tiocolina.

A alelopatia é um fenômeno que ocorre na natureza com liberação de substâncias químicas pelas plantas no meio ambiente que provocam efeitos estimulatórios ou inibitórios na germinação, crescimento e desenvolvimento de outras plantas. Neste sentido, aleloquímicos são agentes que exercem um efeito direto ou indireto (estimulante ou inibitório) sobre outras plantas. Pelo estudo dos processos de alelopatia vê-se que os aleloquímicos, originados do metabolismo secundário, que são liberados no ambiente possuem ação estimulatória em baixa concentração e inibitória com o aumento da concentração.  A descoberta de aleloquimicos que tenham atividade inibitória sobre outras plantas pode ser de grande importância na agricultura para o controle de plantas daninhas. Um bioensaio útil para estabelecer o potencial alelopático de um composto ou extrato de planta é o teste de germinação de sementes e de crescimento radicular e de hipocótilo⁶.

Ainda que o estudo da atividade antibacteriana de óleos essenciais e plantas tenha sido reconhecido empiricamente durante vários séculos, os microorganismos que causam danos à saúde humana estão se tornando cada vez mais resistentes, o que incentiva novas pesquisas. Assim, é de suma importância, desenvolver testes antibacterianos com certas bactérias como Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, consideradas patógenos causadores de infecção hospitalar, que se tornaram progressivamente resistentes a um número cada vez maior de antibióticos ⁷. A atividade antibacteriana pode ser avaliada através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ⁸. O extrato bruto das folhas e caules e frações serão testados frente a microorganismos padrões, conforme recomendado pelo National Committee for Clinical Laboratory Standaards: Staphylococcus aureus – ATCC – 6538 (coco Gram positivo), Escherichia coli – ATCC – 25922 (bacilo Gram negativo) e Pseudomonas aeruginosa (bacilo Gram negativo). O teste é acompanhado de controle negativo (DMSO + bactéria em estudo e BHI) e controle de inibição (BHI + bactéria em estudo + gentamicina). As microplacas são incubadas aerobicamente a 35°C por 24 horas. O crescimento bacteriano é verificado pela adição de um revelador, composto pela solução metanólica a 5% de cloridrato de 2,3,5-trifeniltetrazólio, onde na presença de crescimento bacteriano será  observada uma coloração avermelhada.

A CIM será definida como a última concentração do extrato ou fração capaz de inibir a presença de crescimento bacteriano. Quanto maior a diluição obtida como concentração inibitória mínima (CIM), menor a concentração do extrato necessária para inibir o crescimento bacteriano, que significa também, a melhor atividade antibacteriana do extrato, fração ou composto isolado.

Deste modo, é possível observar a importância da utilização de bioensaios em produtos naturais, seja nas primeiras etapas de seleção de compostos com atividades biológicas, como a citoxicidade, ou mesmo em estágios posteriores na avaliação de possíveis compostos, extratos e frações que possam contribuir na formulação de novos fármacos.

1.    MEYER, B. N.; FERRIGINI, N. R.; PUTNAN, J. E.; JACOBSEN, L. B.; NICHOLS, D.E.; MCLAUGHLIN, J. L.; Planta Medica, 45, 31, 1982.

2.    AMES, B.N.; SHIGENAGA, M. K.; HAGWN, T.M. Process Natl. Academy Science, USA, 90, 7915,1993.
3.    YOKOZAWA, T.; CHEN, C. P.; DONG, E.; TANAKA, T.; NONAKA, G. I.; NISHIOKA, I.; Biochem. Pharmacol. 1998, 56, 213. 
4.    ROGINSKY, V.; LISSI, E. A.; Food Chem. 2005, 92, 235.
5.    INGKANINAN, K., HAZEKAMP, A., DE BEST, C. M., IRTH, H. TJADEN, U. R., VAN DER HEIJDEN, R., VAN DER GREEF , J., VERPOORTE, R. Jornal of Natural Products 63, p.803-806, 2000.
6.    MÁCIAS, F.A.; SIMONET, A.M.; ESTEBAN, M.D. Phytochemistry, 36, 1369, 1994.
7.    SOUZA, G.C.; HAAS, A.P.S.; POSER, G.L. von; SCHAPOVAL, E.E.S.; ELISABETSKY, E.Journal of Ethnopharmacology, v. 90, p. 135-143, 2004.
8.    CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute. Normas de desempenho para testes de sensibilidade antimicrobiana: 15o. suplemento informativo. Wayne: CLSI, 2005. 177 p. (M. 100/ v.25, n.1).

Aldo Sena de Oliveira- Doutorando em Química pela Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
Anderson Luiz Machado- Graduando em Ciências Biológicas- Universidade Federal de Santa Catarina